LC-MS characterization of valsartan degradation products and comparison with LC-PDA

abstract Valsartan was submitted to forced degradation under acid hydrolysis condition as prescribed by the ICH. Degraded sample aliquots were separated via HPLC using a Hypersil ODS (C18) column (250 x 4.6 mm i.d., 5 µm). Either photodiode array (PDA) detection or mass spectrometry (MS) full scan monitoring of HPLC runs were used. HPLC-PDA failed to indicate Valsartan degradation under forced acid degradation, showing an insignificant peak area variation and that Valsartan apparently remained pure. HPLC-MS using electrospray ionization (ESI) and total ionic current (TIC) monitoring did not reveal any peak variation either, but inspection of the ESI mass spectra showed the appearance of m/z 306 and m/z 352 ions for the same retention time as that of Valsartan (m/z 436). These ions were identified as being protonated molecules of two co-eluting degradation products formed by hydrolysis. These assignments were confirmed by ESI-MS/MS with direct infusion of the degraded samples. The results showed that the use of selective HPLC-MS is essential for monitoring Valsartan degradation. Efficient HPLC separation coupled to selective and structural diagnostic MS monitoring seems therefore mandatory for comprehensive drug degradation studies, particularly for new drugs and formulations, and for method development.

resumo Valsartana (VAL) foi submetida à degradação forçada em meio ácido conforme procedimento descrito no ICH. Os produtos de degradação (PDs) foram monitorados ao longo do tempo de degradação pela técnica de Cromatografia Líquida (LC) utilizando uma coluna Hypersil ODS (C18) (250 x 4,6 mm d.i., 5 µm). A detecção foi feita com dois detectores: espectrofotométrico (PDA) e espectrometria de massas (MS) por corrente iônica total. Ambas as técnicas falharam na identificação dos PDs obtidos ao longo do monitoramento, mostrando insignificantes variações na área do pico e permanecendo com pureza de pico ao longo de toda a eluição. Somente depois da avaliação por íon extraído (XIC), foi possível observar o aumento do íon m/z 306 e m/z 352 exatamente no mesmo tempo de retenção do íon molecular (m/z 436). Estes resultados mostram um caso simples e didático em que somente o uso de um método seletivo de LC-MS pode ser utilizado para monitorar produtos de degradação. Neste trabalho, é apresentado um caso real em que a separação por LC deve ser acoplada a métodos seletivos obtidos por MS, especialmente no estudo de PDs para novos fármacos, formulações e no desenvolvimento de métodos.

Production and characterization of surface-active compounds from Gordonia amicalis

Two methods were used to make crude preparations of surface-active compounds (SACs) produced by Gordonia amicalis grown on the medium containing 1% diesel oil. Using a 2:1 (v/v) solution of chloroform:methanol for extraction, Type I SACs were isolated and shown to produce oil in water (O/W) emulsions. Type II SACs were isolated by precipitation with ammonium sulfate and produced predominantly water in oil emulsions (W/O). The crude Type I and II preparations were able to produce a significant reduction in the surface tension of water; however, the crude Type II preparation had 10-25 fold higher emulsification activity than the Type I preparation. Both SAC preparations were analyzed by the TLC and each produced two distinct bands with Rf 0.44 and 0.62 and Rf 0.52 and 0.62, respectively. The partially purified SACs were characterized by the ESI(+)-MS, FT-IR and NMR. In each one of these fractions, a mixture of 10 oligomers was found consisting of a series of compounds, with masses from 502 to 899, differing in molecular mass by a repeating unit of 44 Daltons. The mass spectra of these compounds did not appear to match other known biosurfactants and could represent a novel class of these compounds.

Lipid structural information from a single equine embryo by MALDI-MS / Informação estrutural de lipídios a partir de um único embrião equino pela técnica de MALDI-MS

It was reported the potential of MALDI-MS for the characterization of lipid species present in a single equine embryo, and studied some lipid structures detected by collision induced dissociation (CID) experiments. In the positive ion mode spectrum, it were observed mostly protonated and sodiated species of sphingomyelins (SM), phosphatidylcholines (PC) and triacylglycerols (TAG). In the negative ion mode, it were observed phosphatidylethanolamines (PE) and phosphatidylinositols (PI). MS/MS spectrum of most intense lipid ions was performed to show MALDI-MS/MS structural information potential. MS/MS spectrum in the positive mode of m/z 760.6 (attributed as PC34:1) depicted characteristic PC fragments of m/z 184.1 (choline polar head), and the neutral loss (NL) of 183 (phosphorylcholine). For the ion of m/z 766.6 (attributed as PE 38:5), we observed the NL of 140, characteristic of PE. For the ion of m/z 808.7 (attributed as PC 38.5), besides the fragment at m/z 184.1 at the NL of 183, it was possible to observe the loss of trimethylamine (ion of m/z 749.6), and the cyclophosphane (ion of m/z 147.0). Finally, for the negative ion mode, we isolated and fragmented the ion at m/z 863.6, which was attributed as PI 36:1 due to the presence of m/z 153 (glycerol phosphate – H2 O-H), 223 (phospho inositol – 2H2 O-H), 241 (phospho inositol – H2 O-H), 281 (oleic acid), and 581.3 (lysophosphoinositol – H2 O-H). It was concluded that MALDI-MS allowed the detection of a broad range of PC, SM, PE, PI and TAG lipid species, as well as a fast and confident characterization of lipid structures from a single equine embryo.

É relatado o potencial da técnica de MALDI-MS para caracterizar espécies de lipídios presentes em um único embrião equino e estudadas algumas estruturas lipídicas detectadas por dissociação induzida por colisão (CID). No espectro de modo íon positivo, foram observadas espécies, principalmente, protonadas e sodiadas de esfingomielinas (SM), fosfatidileolinas (PC) e triacilgliceróis (TAG). No modo negativo, foram observadas fosfatidiletanolaminas (PE) e fosfatidilinositos (PI). Espectros de íons de lípidos com maior intensidade foram utilizados para demonstrar o potencial da informação estrutural por MALDI-MS/MS. O espectro no modo positivo de m/z (massa sobre carga) 760,6 (atribuída como PC34:1) apresentou características de fragmentos PC de m/z 184,1 (denominada cabeça polar de colina), além de perda neutral (NL) de m/z 183 (fosforilcolina). Para o íon de m/z 766,6 (atribuída como PE38:5), observou-se a NL de 140, característica do PE. Para o íon de m/z 808,7 (38,5 atribuído como PC), além do fragmento m/z 184,1 na NL de 183, foi possível observar a perda de trimetilamina (íon de m/z 749,6) e o ciclofosfano (íon de m/z 147,0). Finalmente, para o modo de íon negativo, foram isolados e fragmentados o íon de m/z 863,6 que foi atribuído como PI36:1, devido à presença de m/z 153 (fosfato de glicerol – H2 O-H ), 223 (inositol fosfo - 2H2 O-H) , 241 (fosfoinositol – H2 O-H), 281 (ácido oleico) e 581,3 (lisofosfoinositol – H2 O+H). Foi concluído que a MALDI - MS permite a detecção de uma ampla gama de espécies de PC, SM, PE, PI e TAG lipídicas, bem como a caracterização rápida e confiante de estruturas lipídicas a partir de um único embrião equino.

Search for alkaloids on callus culture of Passiflora alata

Preliminary work on Passiflora alata leaves failed to detect harmane alkaloids using LC. The aim of this work was to investigate the production of harmane alkaloids through the cell culture of P. alata, inducing its precursor (L-tryptophan). The leaf explants presented satisfactory results after disinfection, and the callus formation was initiated in MS media with adequate quantities of phytohormones. Sixty days after inoculation, calli were inoculated in the optimized semi-solid MS media, with and without the addition of L-tryptophan (50, 100, 200 mg/L) and kept in standard conditions for 90 days. Calli were collected on days 6, 16, 26, 36, and 90, followed by acid-base extraction, and analysed by LC. The results showed an absence of harmane, harmin, harmol, harmalol, and harmaline. With L-tryptophan feeding, two peaks were detected, collected and analysed through positive mode electrospray [ESI(+)-MS] and sequential analysis in tandem ESI(+)-MS/MS. The spectra obtained were very similar, with a repetition of the more intense ions, and consecutive loss of 68 Da units, attributed to the heterocycle pyrazole. It appeared that this transformation was not related to any enzymatic pathway previously described for the plant from L-tryptophan, and the biosynthesis of β-carboline alkaloids in callus culture of P. alata were not observed in this work.

As folhas de varias espécies de Passiflora são utilizadas como ansioliticas e sedativas. Passiflora alata Curtis, Passifloraceae consta em três edições da farmacopéia brasileira, porem não há muitos estudos sobre sua composição química. No passado, enfatizava-se a ação conjunta de alcalóides e flavonóides. Em trabalho anterior, não foi detectada a presença de alcalóides harmanicos através de CLAE. Assim, decidiu-se investigar a produção dos mesmos através de cultivo celular, introduzindo seu precursor metabólico L-triptofano. Os explantes foliares apresentaram resultados satisfatorios para germinação apos assepsia, e a formação de calo foi iniciada em meio MS com quantidades adequadas de fitohormonios, previamente determinadas. Sessenta dias após a inoculação os calos foram repicados para meio semi-solido com e sem L-triptofano (50, 100, 200 mg/L), mantidos por 90 dias em condições padrão. Amostras foram coletadas com 6, 16, 26, 36, e 90 dias, realizada extração acido-base e o extrato analisado por CLAE. Os resultados mostraram a ausência de harmana, harmina, harmol, harmalol e harmalina. Dois picos presentes nas amostras com L-triptofano foram coletados e analisados através de espectrometria de massas, electrospray modo positiva [ESI(+)-MS] e analise em tandem ESI(+)-MS/MS. Os espectros correspondentes foram similares, mostrando a perda consecutiva de 68 Da, atribuídos ao pirazol. Este fato aponta para uma transformação não enzimática, não relacionada a uma biossintese previamente descrita para alcalóides β-carbolínicos.

19-base pair deletion polymorphism of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene: maternal risk of Down syndrome and folate metabolism / Polimorfismo de deleção de 19 pares de bases do gene dihidrofolato redutase (DHFR): risco materno para síndrome de Down e metabolismo do folato

CONTEXT AND OBJECTIVE: Polymorphisms in genes involved in folate metabolism may modulate the maternal risk of Down syndrome (DS). This study evaluated the influence of a 19-base pair (bp) deletion polymorphism in intron-1 of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene on the maternal risk of DS, and investigated the association between this polymorphism and variations in the concentrations of serum folate and plasma homocysteine (Hcy) and plasma methylmalonic acid (MMA). DESIGN AND SETTING: Analytical cross-sectional study carried out at Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp). METHODS: 105 mothers of individuals with free trisomy of chromosome 21, and 184 control mothers were evaluated. Molecular analysis on the polymorphism was performed using the polymerase chain reaction (PCR) through differences in the sizes of fragments. Folate was quantified by means of chemiluminescence, and Hcy and MMA by means of liquid chromatography and sequential mass spectrometry. RESULTS: There was no difference between the groups in relation to allele and genotype frequencies (P = 0.44; P = 0.69, respectively). The folate, Hcy and MMA concentrations did not differ significantly between the groups, in relation to genotypes (P > 0.05). CONCLUSIONS: The 19-bp deletion polymorphism of DHFR gene was not a maternal risk factor for DS and was not related to variations in the concentrations of serum folate and plasma Hcy and MMA in the study population.

CONTEXTO E OBJETIVO: Polimorfismos em genes do metabolismo do folato podem modular o risco materno para síndrome de Down (SD). Este estudo avaliou a influência do polimorfismo de deleção de 19 pares de base (pb) no íntron 1 do gene dihidrofolato redutase (DHFR) no risco materno para SD e investigou a associação entre esse polimorfismo e variações nas concentrações de folato sérico, homocisteína (Hcy) e ácido metilmalônico (MMA) plasmáticos. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo transversal analítico realizado na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp). MÉTODOS: 105 mães de indivíduos com trissomia livre do cromossomo 21 e 184 mães controles foram avaliadas. A análise molecular do polimorfismo foi realizada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) por diferença de tamanho dos fragmentos. O folato foi quantificado por quimioluminescência, e Hcy e MMA foram determinados por cromatografia líquida/espectrometria de massas sequencial. RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação às frequências alélica e genotípica (P = 0,44; P = 0,69, respectivamente). As concentrações de folato, Hcy e MMA não mostraram diferença significativa entre os genótipos, entre grupos (P > 0,05). CONCLUSÕES: O polimorfismo de deleção de 19 pb do gene DHFR não é um fator de risco materno para SD e não está relacionado com variações nas concentrações de folato sérico, Hcy e MMA plasmáticos na população estudada.

Homocisteína e polimorfismos dos genes MTHFR e VEGF: impacto na doença arterial coronariana / Homocisteína y polimorfismos de los genes MTHFR y VEGF: impacto en la enfermedad arterial coronaria / Homocysteine and MTHFR and VEGF gene polymorphisms: impact on coronary artery disease

FUNDAMENTO: Polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento da aterosclerose, angiogênese e metabolismo da homocisteína (Hcy) podem ser fatores de risco para a doença arterial coronariana (DAC). OBJETIVO: Avaliar o efeito dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T na DAC e a associação desses polimorfismos com a gravidade e a extensão das lesões ateroscleróticas e concentrações de Hcy. MÉTODOS: 244 indivíduos foram avaliados através de angiografia coronariana e incluídos no estudo (145 com DAC e 99 indivíduos-controle). Os polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T foram investigados através das técnicas de PCR-SSCP e PCR-RFLP, respectivamente. Os níveis de homocisteína plasmática foram mensurados através de cromatografia líquida/espectrometria de massa seqüencial (CL/EMS). RESULTADOS: Não houve diferença significante em relação à distribuição de alelos e genótipos entre os grupos, para ambos os polimorfismos. A análise univariada mostrou uma freqüência maior do genótipo VEGF -2578AA no grupo com doença em três vasos (p=0,044). Além disso, o genótipo VEGF -2578CA foi observado mais freqüentemente entre indivíduos com <95 por cento de estenose (p=0,010). Após ajuste para outros fatores de risco para DAC em um modelo multivariado, observou-se que o polimorfismo VEGF C-2578A não era um correlato independente da DAC (p=0,688). O polimorfismo MTHFR não mostrou qualquer relação com a extensão e/ou gravidade da DAC. O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou uma associação direta com hiperhomocisteinemia ou aumento das concentrações médias de Hcy no plasma. CONCLUSÃO: Embora haja uma aparente associação entre o polimorfismo VEGF C-2578A e o desenvolvimento de aterosclerose coronariana, essa associação não é independente dos fatores de risco cardiovasculares convencionais.

BACKGROUND: Polymorphisms in genes involved in the atherosclerosis development, angiogenesis, and homocysteine (Hcy) metabolism could be risk factors for coronary artery disease (CAD). OBJECTIVE: To evaluate the effect of the VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms on CAD, and the association of these polymorphisms with the severity and extension of atherosclerotic lesions and Hcy concentrations. METHODS: Two hundred and forty-four subjects were evaluated by coronary angiography and included in the study (145 with CAD and 99 controls). The VEGF C-2578A and MTHFR C677T polymorphisms were investigated by the PCR-SSCP and PCR-RFLP techniques, respectively. Plasma Hcy was quantified by liquid chromatography/sequential mass spectrometry (LC-MS/MS). RESULTS: There was no significant difference in allele and genotype distribution between the groups, for both polymorphisms. The univariate analysis showed a higher frequency of the VEGF -2578AA genotype in the group with three-vessel disease (p=0.044). In addition, the VEGF -2578CA genotype was observed more frequently among individuals with <95 percent stenosis (p=0.010). After adjustment for other risk factors for CAD in a multivariate model, the VEGF C-2578A polymorphism was not found to be an independent correlate of CAD (p=0.688). The MTHFR polymorphism did not show any association with the extension and/or severity of the CAD. The MTHFR C677T polymorphism showed no direct association with hyperhomocysteinemia or increased mean plasma concentrations of Hcy. CONCLUSION: Although there is an apparent association between VEGF C-2578A and the development of coronary atherosclerosis, this association is not independent of conventional cardiovascular risk factors.

FUNDAMENTO: Polimorfismos en genes relacionados al desarrollo de la aterosclerosis, la angiogénesis y el metabolismo de la homocisteína (Hcy) pueden ser factores de riesgo para la enfermedad arterial coronaria (EAC). OBJETIVO: Evaluar el efecto de los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T en la EAC y la asociación de esos polimorfismos con la severidad y la extensión de las lesiones ateroscleróticas y concentraciones de Hcy. MÉTODOS: Se evaluaron a 244 individuos por medio de angiografía coronaria y se les incluyeron en el estudio (145 con EAC y 99 individuos-control). Los polimorfismos VEGF C-2578A y MTHFR C677T se investigaron mediante las técnicas de PCR-SSCP y PCR-RFLP, respectivamente. Se midieron los niveles de homocisteína plasmática por medio de cromatografía líquida/espectrometría de masa secuencial (CL/EMS). RESULTADOS: No hubo diferencia significante en relación con la distribución de alelos y genotipos entre los grupos, para ambos polimorfismos. El análisis univariado reveló una frecuencia mayor del genotipo VEGF-2578AA en el grupo con enfermedad en tres vasos (P=0,044). Además de ello, se observó el genotipo VEGF-2578CA con más frecuencia entre individuos con <95 por ciento de estenosis (p=0,010). Tras ajuste para otros factores de riesgo para EAC en un modelo multivariado, se evidenció que el polimorfismo VEGF C-2578A no era un correlato independiente de la EAC (p=0,688). El polimorfismo MTHFR no mostró cualquier relación con la extensión y/o severidad de la EAC. El polimorfismo MTHFR C677T no evidenció una asociación directa con hiperhomocisteinemia o aumento de las concentraciones promedio de Hcy en el plasma. CONCLUSIÓN: Si bien existe una aparente asociación entre el polimorfismo VEGF C-2578A y el desarrollo de aterosclerosis coronaria, esa asociación no es independiente de los factores de riesgo cardiovasculares convencionales.

Hiper-homocisteinemia em pacientes submetidos a transplante renal / Hyperhomocysteinemia in renal transplant recipients

A doença vascular do transplante apresenta fisiopatogenia semelhante a do processo de envelhecimento vascular e da aterosclerose. Consequentemente, genes cujas enzimas estão ligadas a esse processo, como a enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) que participa do metabolismo da homocisteína e formação da placa aterosclerótica, passaram a ser valorizados no processo etiopatológico da disfunção crônica do transplante (DCTx). Neste estudo, as frequências dos polimorfismo MTHFR (C677T e A1298C) e os níveis plasmáticos de homocisteína (Hcy) foram avaliados em 45 pacientes submetidos a transplante renal no mínimo há 12 meses, 21 com DCTx e 24 com função renal normal (FN). A quantificação da hemocisteína foi realizada por cromatografia líquida/espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) e a investigação dos polimorfismo MTHFR pela análise de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP). O genótipo 677CT/1298AC foi associado ao nível moderado de Hcy em pacientes com DCTx